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Contents :
1. Time-Domain Fluorescence Spectroscopy Using Time-Correlated
Single-Photon Counting
David J. S. Birch and Robert E. Imhof
1.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1. What Is a Fluorescence Lifetime?. . . . . . . . . . . . . . 2
1.1.2. Methods of Measuring Fluorescence Lifetimes . . . . . . . . 4
1.1.3. Analytical Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2. The Single-Photon Technique. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.1. Basic Principles. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.2. Statistics and Pileup . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
1.2.3. Instrumental Response and Convolution . . . . . . . . . . .14
1.3. Data Analysis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
1.3.1. Formulation of the Problem. . . . . . . . . . . . . . . . .17
1.3.2. Least-Squares Fitting . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
1.3.3. Fitting Algorithms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
1.3.4. Anisotropy Analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
1.4. Instrumentation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
1.4.1. Pulsed Light Sources. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
1.4.2. Optical Components. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
1.4.3. Detectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
1.4.4. Electronics and Computer Hardware . . . . . . . . . . . . .47
1.5. Applications and Performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
1.5.1. Exponential Decay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
1.5.2. Nonexponential Decay. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
1.5.3. Anisotropy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
1.5.4. Time-Resolved Spectra . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
1.6. Multiplexing Techniques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
1.6.1. Differential Pulse Fluorometry. . . . . . . . . . . . . . .75
1.6.2. T-Format Studies. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
1.6.3. Array Fluorometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .88
2. Laser Sources and Microchannel Plate Detectors for
Pulse Fluorometry
Enoch W. Small
2.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .97
2.2. Laser Sources. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .99
2.2.1. Laser Fundamentals. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.2.2. The Argon Ion, Nd:YAG, and Dye Lasers-Energy Levels
and Physical Layout . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
2.2.3. Laser Pulse Generation. . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
2.3. The Microchannel Plate (MCP) Photomultiplier . . . . . . . . . . 146
2.3.1. How an MCP Photomultiplier Works. . . . . . . . . . . . . 147
2.3.2. Photomultiplier Performance . . . . . . . . . . . . . . . 155
2.4. Tuning a Monophoton Decay Fluorometer for High Performance . . . 168
2.4.1. Judging the Quality of Data . . . . . . . . . . . . . . . 168
2.4.2. Tuning. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
2.4.3. Performance of a Tuned Instrument . . . . . . . . . . . . 174
2.5. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180
3. Streak Cameras for Time-Domain Fluorescence
Thomas M. Nordlund
3.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183
3.1.1. What Is a Streak Camera?. . . . . . . . . . . . . . . . . 183
3.1.2. Scope of the Chapter. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
3.1.3. Basic Features and Abilities of a Photoelectronic
Streak Camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186
3.1.4. History . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187
3.2. System Building Blocks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
3.2.1. Modes of Operation. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
3.2.2. Image Converter Tube. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
3.2.3. Image Intensifiers. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 205
3.2.4. Signal Readout and Storage. . . . . . . . . . . . . . . . 208
3.2.5. Computer and Data Manipulation. . . . . . . . . . . . . . 212
3.3. Streak Camera Capabilities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
3.3.1. Detector Characteristics. . . . . . . . . . . . . . . . . 213
3.3.2. Signal Averaging. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
3.3.3. Streak Cameras and Time-Resolved Single-Photon Counting . 223
3.4. Time Dependence of Fluorescence. . . . . . . . . . . . . . . . . 225
3.4.1. Decay Times . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 225
3.4.2. Rise Times. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231
3.4.3. Physical Processes and Characteristic Times . . . . . . . 233
3.5. Wavelength Dependence of Fluorescence. . . . . . . . . . . . . . 233
3.5.1. Measurement of Time and Wavelength Dependence of
Signals: Additional Time Dispersion . . . . . . . . . . . 234
3.5.2. Time Dependence of Emission Spectra . . . . . . . . . . . 237
3.6. Two-Dimensional Detection: Space and Time Coordinates. . . . . . 239
3.6.1. Position and Time Detection . . . . . . . . . . . . . . . 239
3.6.2. Two-Dimensional Spatial Detection . . . . . . . . . . . . 240
3.7. Fluorescence Anisotropy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
3.7.1. Simultaneous versus Separate Measurements . . . . . . . . 242
3.7.2. Signal-to-Noise Ratio . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244
3.8. Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
3.8.1. Laser Diagnostics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245
3.8.2. Solid-State Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246
3.8.3. Solutions: Molecular Relaxation in Solvents . . . . . . . 247
3.8.4. Biological Systems. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249
3.8.5. X-Ray Streak Cameras: Fusion Reactions. . . . . . . . . . 252
3.9. The Future . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 254
3.9.1. The 0.1-20-ps Time Regime . . . . . . . . . . . . . . . . 254
3.9.2. Integrated Detection Systems. . . . . . . . . . . . . . . 255
3.9.3. Time-Resolved Photon-Counting Streak Cameras (TRPCSC) . . 255
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256
4. Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy Using Synchrotron Radiation
Ian H. Munro and Margaret M. Martin
4.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261
4.2. Proteins and Peptides. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262
4.2.1. Lumazine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
4.2.2. Angiotensin II. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266
4.2.3. Lactate Dehydrogenase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270
4.3. Photosynthesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272
4.4. Membranes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
4.4.1. Diphenylhexatriene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276
4.4.2. Triazine Dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 279
4.5. Excited State Processes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281
4.5.1. Host/Guest Complexes. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282
4.5.2. Stilbene. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283
4.5.3. The Vacancy in Diamond. . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289
5. Frequency-Domain Fluorescence Spectroscopy
Joseph R. Lakowicz and Ignacy Gryczynski
5.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293
5.2. Comparison of Time- and Frequency-Domain Fluorometry . . . . . . 294
5.2.1. Intensity Decays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
5.2.2. Anisotropy Decays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
5.3. Theory of Frequency-Domain Fluorometry . . . . . . . . . . . . . 302
5.3.1. Decays of Fluorescence Intensity. . . . . . . . . . . . . 302
5.3.2. Decays of Fluorescence Anisotropy . . . . . . . . . . . . 304
5.4. Instrumentation and Applications . . . . . . . . . . . . . . . . 305
5.4.1. FD Instruments with Intensity-Modulated Light Sources . . 305
5.4.2. A 2-GHz Harmonic Content FD Instrument. . . . . . . . . . 309
5.4.3. Resolution of Anisotropy Decays . . . . . . . . . . . . . 316
5.5. Future Developments. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
5.6. Summary. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 331
6. Fluorescence Correlation Spectroscopy
Nancy L. Thompson
6.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 337
6.2. Conceptual Basis and Theoretical Background. . . . . . . . . . . 337
6.3. Experimental Apparatus and Methods . . . . . . . . . . . . . . . 343
6.4. Analysis of Autocorrelation Function Magnitudes. . . . . . . . . 351
6.4.1. Number Densities. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 351
6.4.2. Molecular Weights . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 352
6.4.3. Molecular Aggregation and Polydispersity. . . . . . . . . 353
6.5. Analysis of Autocorrelation Function Temporal Decays . . . . . . 354
6.5.1. Translational Diffusion . . . . . . . . . . . . . . . . . 354
6.5.2. Flow and Sample Translation . . . . . . . . . . . . . . . 357
6.5.3. Kinetic Rate Constants. . . . . . . . . . . . . . . . . . 359
6.6. Special Versions of FCS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
6.6.1. Nonideal Solutions. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 361
6.6.2. Rotational Diffusion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362
6.6.3. Total Internal Reflection Illumination. . . . . . . . . . 364
6.6.4. High-Order Autocorrelation. . . . . . . . . . . . . . . . 369
6.6.5. Cross-Correlation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373
6.7. Summary and Future Directions. . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
7. Fundamentals of Fluorescence Microscopy
Robert A. White, Karl J. Kutz, and John E. Wampler
7.1. Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 379
7.1.1. Sensitivity and Its Limitations . . . . . . . . . . . . . 382
7.1.2. Visualization versus Quantitation . . . . . . . . . . . . 382
7.2. The Illumination Light Path of the Fluorescence Microscope . . . 384
7.2.1. Lamps . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386
7.2.2. Lamp Housing. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387
7.2.3. Auxiliary and Alternative Optics. . . . . . . . . . . . . 389
7.2.4. The Objective Lens as Condenser . . . . . . . . . . . . . 397
7.2.5. Specimen and Mount. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 397
7.3. The Imaging Light Path in Fluorescence Microscopy. . . . . . . . 398
7.3.1. The Specimen as an Optical Component. . . . . . . . . . . 398
7.3.2. The Objective . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
7.3.3. Optics between Objective and Eyepiece . . . . . . . . . . 402
7.3.4. Role and Position of Ocular . . . . . . . . . . . . . . . 403
7.3.5. Detector Placement for Electronic Imaging and
Photometry. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 407
8. Flow Cytometry and Cell Sorting
Laszlo Matyus and Michael Edidin
8.1. Introduction/History . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411
8.2. Operation of Flow Cytometers . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413
8.2.1. Sample Handling and Delivery Systems. . . . . . . . . . . 416
8.2.2. The Nozzle and the Sheath Fluid . . . . . . . . . . . . . 416
8.2.3. Light Sources . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 417
8.2.4. The "Intersection Point". . . . . . . . . . . . . . . . . 418
8.2.5. Detectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420
8.2.6. Electronics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
8.2.7. Data Analysis and Storage . . . . . . . . . . . . . . . . 424
8.2.8. Slit-Scan Flow Cytometry. . . . . . . . . . . . . . . . . 425
8.2.9. Cell Sorting. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
8.3. Parameters of Flow Cytometry . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428
8.3.1. Light Scatter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428
8.3.2. Fluorescence. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 428
8.4. Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 440
Index. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
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